Технология производства низина. Антибиотические свойства низина
Работа из раздела: «
Технология»
Р Х Т У
им. Д.И.Менделеева.
Технология производства низина.
Антибиотические свойства низина.
Выполнила:
студентка группы Э-45
Тимошкина Е.А.
10. 05. 1997
НИЗИНЫ (NISINS).
Низины относятся к антибиотикам, которые образуются собственно
бактериями. Антибиотическое вещество - низин - выделен из культуры
молочнокислого стрептококка Streptococcus lactis. Низин подавляет развитие
ряда грамположительных и некоторых кислотоустойчивых бактерий, не оказывает
влияния на грамотрицательные бактерии, дрожжи и плесневые грибы. Этот
антибиотик подавляет развитие многих микроорганизмов: пневмококки, группу
стрептококков, различные виды Bacillus , Clostridium, Mycobacterium
tuberculosis, Lactobacillus, Corynebacterium, немногие виды Streptomyces,
Micrococcus pyogenes. Низин не оказывает антимикробного действия на
Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella, некоторые виды Neisseria.
Свойства низина, а также особенности его химического строения привлекли к
этому антибиотику внимание ученых. Что касается применения, следует
отметить, что низин не используется в медицинской практике, но с успехом
применяется в ветеринарии для лечения маститов у коров. Также имеет большое
применение в пищевой промышленности в качестве консерванта некоторых
скоропортящихся продуктов, а также для предупреждения порчи сыров. Есть
сообщения об активности низина в отношении малярийного плазмодия, но этот
вопрос пока остается не до конца изученным.
Строение низина.
Установлено, что низин имеет молекулярную массу, равную 3500, он может
полимеризоваться и образовывать димер (молекулярная масса 7000) и тетрамер.
Полимеризацию низина связывают с наличием в его молекуле дегидроаланина. В
состав молекулы низина входят 30 аминокислотных остатков следующих
аминокислот: лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин, пролин, глицин,
аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, остатки редко встречающихся
серосодержащих аминокислот: лантионин и (-метиллантионин, ненасыщенные
аминокислоты - дегидроаланин и (-метилдегидроаланин.
В 1970 году установлена следующая структура молекулы низина:
H2N - Иле - Мга - Ала - Иле - Дга - Лей - Ала - Амк - Про - Глу - Ала -
S
S
- Лиз - Амк - Гли - Ала - Лей - Мет - Гли - Ала - Асп - Мет - Лиз -
S
S
- Амк-Ала- Амк - Ала - Гис - Ала - Сер - Иле - Гис - Вал - Дга - Лиз - СООН
Дга - дегидроаланин; Амк - аминомасляная кислота; Мга - (-метилдегид-
роаланин. Определено положение двух сульфидных мостиков, образованных
остатками (-метиллантионина. Этот фрагмент имеет бициклическую структуру:
Биологическая активность низина обусловлена наличием в его молекуле (,(-
ненасыщенных аминокислот (дегидроаланин, (-метилдегидроаланин). Димеры и
тетрамеры низина, подобно мономеру, обладают биологической активностью.
Низин влияет на споры чувствительных к нему бактерий, которые более богаты
катионами по сравнению с вегетативными клетками, и выступает как
катионитный детергент. Низин, адсорбируясь на поверхности спор, в момент
прорастания спор нарушает прониаемость цитоплазматичесой мембраны и таким
образом подавляет рост развивающихся клеток бактерий. Этот антибиотик
способен реагировать с сульфгидрильными группами биологически важных
соединений, выводя их из реакций метаболизма.
Технологические стадии производства низина.
1. Приготовление посевного материала.
Штаммы-продуценты
из пробирок
(
в колбы со стерильной питательной средой на качалки, оптимальные tо и
рН=6.5 - 6.8.
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
( (
(
(
(
(
(
(
(
(
(
Инокуляторы для наращивания посевного материала (малый посевной аппарат,
затем большой посевной аппарат; постоянный долив питательной среды)
(
С понижением рН среды увеличивается выделение низина из клеток в
культуральную жидкость. При рН=4.3 более 90% низина выделяется в среду, а
при рН=6.8 выделяется 40% антибиотика.
( Но интенсивная аэрация культуры молочнокислого стрептококка не оказывает
благоприятного влияния ни на рост бактерий, ни на образование низина.
Питательная среда: в средах, содержащих недостаточное для нормального
развития количество азота (1-2 мг% NH2 при норме 29 мг%), сильно снижается
рост стрептококка и образование антибиотика. Лучшими азотсодержащими
компонентами в средах являются дрожжевой автолизат, пептон, казеиновый
гидролизат. Высокий выход антибиотика наблюдается при развитии
молочнокислого стрептококка на средах, содержащих аммонийные соли
органических кислот.
Источник углерода - глюкоза. Добавление к среде с глюкозой двух-, трех-,
четырех- и пятиуглеродных органических кислот способствует повышению роста
продуцента антибиотика и некоторому увеличению образования им низина.
При засеве свежей питательной среды культурой Streptococcus lactis вместе с
посевным материалом вносится и низин, так как количество общего низина в
процессе развития бактерий снижается и к концу периода лаг-фазы клетки
стрептококка практически не содержат антибиотика. А синтез низина
происходит после экспоненциального роста бактерий в период ранней
стационарной фазы.
2. Установка для биосинтеза антибиотика
(
(
(
(
(
(
(
(
(
( (
(
(
( (
(
(
(
(
(
( (
(
Снижение общего количества низина в лаг-период развития Streptococcus
lactis и синтез антибиотика в более поздний период роста подтверждает
значение низина в качестве важной части бактериального ростового цикла
стрептококка (низин, по-видимому, связан с контролирующим механизмом,
который не оказывает влияния на скорость роста продуцента антибиотика, но
задерживает начало роста новых клеток). Снижение синтеза антибиотика к
концу периода лаг-фазы обусловлено изменением третичной структуры или
степени полимеризации антибиотика. Этого процесса инактивации низина можно
избежать путем добавления в среду казеина, в результате чего наблюдается
стабилизация антибиотической активности и большое образование низина. У
низина в отличие от других полипептидных антибиотиков путь синтеза сходен с
путем образования белков, т.е. связан с рибосомным механизмом. Синтез
низина идет через образование низиноподобных белков-предшественников
биосинтеза антибиотика, причем превращение пренизина в низин происходит под
действием фермента на внешней поверхности клетки стрептококка (есть
предположение и о том, что ответственность за биосинтез низина несут
определенные плазмиды, в которых локализованы соответствующие гены
образование молекулы антибиотика). Сам механизм биосинтеза низина и его
молекулярная масса позволяют рассматривать этот антибиотик не как
полипептид, а как низкомолекулярный основной белок.
3. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток
микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы
продуцента).
( (
(
(
( (
(
(
(
(
(
( ( ( (
(
В результате рассмотренных аспектов биосинтеза видно, что образуемый
антибиотик почти полностью выделяется из клеток в культуральную жидкость
(б(льшая часть его). Тогда антибиотик выделяют из культуральной жидкости
методами экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой,
осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными
смолами. При содержании антибиотика (как в нашем случае) в культуральной
жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является
перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его
изолировать. При этом антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и
клетки с антибиотическим веществом, переводят в осадок, из которого
антибиотик экстрагируют. Отделение нативного раствора от биомассы и
взвешенных частиц проводят методами фильтрации (нутч-фильтр, друк-фильтр,
сепараторы) или центрифугирования.
Стадия выделения и очистки антибиотика
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
Во избежание инактивации антибиотика под влиянием внешних факторов при его
выделении и очистке необходимо соблюдать максимальную осторожность.
Основные методы очистки:
Метод экстракции (Многократный перевод антибиотика из одного растворителя в
другой с предварительным осаждением (кристаллизацией)).
Ионообменная сорбция (Пропускание водного раствора антибиотика через
колонки с соответствующими ионообменными смолами, сорбция на них, а раствор
с примесями, имеющий противоположный антибиотику заряд, проходит через
колонку. Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют, получают очищенный,
концентрированый препарат. А раствор можно вновь пропустить через
ионообменную смолу, но с противоположным зарядом, тогда на смоле осядут
примеси, а более очищенный раствор пройдет через колонку.
Осаждение (Связывание антибиотика с веществами с целью получения
соединения, выпадающего в осадок, который с помощью фильтров или
центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают, высушивают.
Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь
осаждают. )
Одна из стадий очистки - концентрирование полученных растворов (отгонка
большей части растворителя в вакууме).
Стадия сушки, получение готовой продукции, изготовление лекарственных форм
(биологический и фармакологический контроль), расфасовка.
Виды сушки: лиофильная сушка (при температуре -8, -12 (С)
распылительная сушилка (раствор антибиотика пневматически распыляется до
мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха)
сушка в вакуум-сушильных шкафах (для высушивания зернистых и пастообразных
антибиотических препаратов).
Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической
активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.
